Eximbanker.com

Cómo calcular la concentración de anticuerpos

Cómo calcular la concentración de anticuerpos


Uno de los métodos más comunes de cálculo de una concentración de proteína en un entorno de laboratorio debe utilizar un ensayo de Bradford. El reactivo de Bradford es un reactivo colorimétrico que cambia de color basado en la concentración de proteína. Mediante la combinación de una curva estándar conocida con el reactivo de Bradford, puede crear una medida contra la cual se puede calcular la concentración de cualquier proteína, incluyendo anticuerpos.

Instrucciones

Crear un estándar

•  medida de 200 mg de BSA sobre papel utilizando una escala de laboratorio de pesaje. Encerrarlo en un tubo de microcentrífuga. Añadir 2ml de buffer para el tubo de microcentrífuga que contiene 200 mg de BSA. Etiquetar este tubo "1."

•  vortex tubo 1 hasta que la BSA se haya disuelto completamente.

•  Retire 500 ul de la BSA en buffer y transferir a un segundo tubo. Etiquetar este tubo "2". Añadir 500 ul de buffer simple en tubo de 2.

•  quitar 200 ul de BSA en buffer de 1 tubo y transferir a un tubo nuevo. Etiquetar este tubo "3". Añadir 800 ul de tampón liso al tubo 3.

•  saque 100 ul de BSA en buffer 1 tubo y transferir a un tubo nuevo. Etiquetar este tubo «4.» Agregar 900 ul de tampón liso al tubo 4.

•  Retire 10 ul de BSA en buffer de 1 tubo y transferir a un tubo nuevo. Etiquetar este tubo "5." Añadir 990 ul de tampón liso tubo 5. Tubos 1 - 5 constituyen una serie graduada estándar. El primer tubo tiene una concentración conocida de 100 mg/ml; la segunda, 50 mg/ml; la tercera, 20 mg/ml, la cuarta, 10 mg/ml; y el quinto, 1 mg/ml. Cada tubo contiene aproximadamente 1ml de solución.

Crear anticuerpo diluciones

•  5 añadir 0ul de anticuerpo purificado al 95 0ul de tampón. Etiquetar este tubo "a".

•  agregar 10 ul de anticuerpo purificado a 990 ul de tampón. Etiquetar este tubo "B".

•  agregar 2 ul de anticuerpo purificado a 998 ul de tampón. Etiquetar este tubo "C."

La placa de carga

•  colocar 0,5 ml de tampón normal en los primeros pozos en dos columnas de la placa de pocillos.

•  colocar 0,5 ml del contenido del tubo 1 en los pozos de la segundo de las dos primeras columnas de la placa de pocillos. Continuar la serie gradual hasta que las dos primeras columnas contienen 0,5 ml de una solución estándar de BSA de cada uno de los tubos 1-5, incluyendo pozos de búfer llano.

•  Añadir 0,5 ml de reactivo de Bradford a cada pocillo. Remolino de la placa para mezclar el reactivo con las soluciones proteináceas, teniendo cuidado de no derramar el contenido de cualquiera de los pozos. Espere 5 minutos.

•  Lea la placa según el protocolo específico a su lector de placas a una longitud de onda de 595 nm.

Calcular la concentración de anticuerpos

•  copia que los valores de leen desde el lector de placas a Microsoft Excel.

•  crear un gráfico de las dos columnas de valores que representan el estándar de BSA utilizando al Asistente para gráficos en Microsoft Excel.

•  trazar los puntos medidos de las diluciones de anticuerpo en el gráfico de Excel. Leer la correspondiente concentración de proteínas según el valor del eje y el punto de dilución del anticuerpo en el gráfico de Excel.

•  dependiendo de si está utilizando los valores obtenidos de tubo A, B o C, multiplique el valor por 20, 40 y 500, respectivamente. El valor resultante es la concentración de su anticuerpo purificado.