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Cómo hacer una calibración estándar para un hplc

Cómo hacer una calibración estándar para un hplc


Cuando se trabaja con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), buena calibración es absolutamente esencial para asegurar resultados confiables y de calidad. Correcta calibración de un instrumento HPLC comienza con la elaboración de un estándar de calibración adecuado. En la mayoría de los casos, calibración de hecho requiere una serie de estándares de concentración creciente para producir lo que se conoce como una curva de calibración. Se trata de una línea trazada y el asociado ecuación que describe la relación entre la concentración de la sustancia ensayada para y la respuesta de los detectores HPLC.

Instrucciones

•  determinar la sustancia que desea probar para usar HPLC ("analito"). Por ejemplo, podría desea probar una serie de refrescos para la fructosa contenida, en cual caso fructosa sería el analito.

•  obtener una cantidad de la sustancia analito de pureza adecuada. Normalmente debe ser pureza superior al 99% y analito debe comprarse en una empresa de buena reputación suministro de productos químicos. En el caso de la fructosa, por ejemplo, usted debería adquirir fructosa pura de un vendedor de químico y no de una tienda de comestibles.

•  determinar las concentraciones máximas y mínimas esperadas del analito en las muestras que desea probar en el HPLC. En el caso de refrescos, sería examinar las etiquetas de las bebidas y determinar el contenido de fructosa más bajo y más alto entre las bebidas que pondrá a prueba. Tenga en cuenta que la muestra inicial (el refresco) puede ser diluida o manipular lo contrario durante la preparación para el análisis (dependiendo del método HPLC se utiliza) y por lo tanto la concentración de analito en las muestras realmente inyectada en el HPLC puede ser modificada. Es la concentración de analito en las muestras como en el HPLC que debe considerarse.

•  determinar el disolvente en el cual se disolverá el analito a patrones de calibración. Este solvente debe poder disolver adecuadamente el analito sobre una gama relativamente amplia de concentración (por lo menos tan alta como en las muestras que se va a probar). Así, este solvente ideal debe ser bastante similar a la "fase móvil:" el solvente usado para llevar las muestras a través del instrumento HPLC.

•  calcular la cantidad de analito necesaria para hacer una "norma común" solución del analito. Esta se encuentra multiplicando la concentración del stock estándar requerida por el volumen deseado. La concentración del analito en esta solución debe ser por lo menos 10% mayor que la concentración más alta de la muestra prevista. Si prevé la mayor concentración de fructosa en un refresco muestra es 8 gramos/100 ml, entonces la acción estándar podría realizarse a una concentración de 10 g fructosa/100 ml. Un razonable volumen es de 500 mililitros, por lo tanto 8/100 ml x 500 mL = 40 gramos de fructosa sería necesaria.

•  pesar la cantidad necesaria de analito para un nivel adecuado de precisión. A menudo un valor de peso en gramos exactas con uno o dos decimales es adecuado, pero más precisión puede ser necesario para algunos métodos.

•  transferencia de analito pesado a un matraz aforado de volumen necesario y agregue el solvente deseado a la marca de llenado en el matraz. El uso de un matraz volumétrico (en lugar de un vaso de precipitados graduado, por ejemplo) aumenta la precisión del valor de stock concentración estándar. Asegurar que todo el analito se transfiere al matraz; Use algunos de los solventes para lavar, si es necesario.

•  tapar la Fiola y agite suavemente o invertir hasta que el analito se haya disuelto completamente.

•  realizar una serie de diluciones diferentes de la población estándar mediante la transferencia de volúmenes conocidos de la población estándar en matraces aforados, utilizando pipetas de transferencia exacta, entonces agregando solvente. La menor concentración estándar debe estar debajo del más baja esperada muestra que debe analizarse. En el ejemplo de refresco, si la menor concentración de fructosa esperados en una muestra es de 2 gramos / 100ml, entonces un 1 gramo / 100ml estándar podría hacerse. Esto sería hecha por una dilución décuplo del stock estándar. La serie estándar debe incluir un total de 5 o 6 concentraciones, diluciones adicionales para producir estándares de tal vez 3, 5 y 8 gramos de fructosa/ml sería necesarias. Ahora tienes una serie de soluciones estándar con el que calibrar la HPLC.